03-28 09:03 阅读 477

Bismark工具介绍

简介

Bismark是一个灵活的工具，可以高效地分析BS-Seq数据，方便地进行读段比对和甲基化探测，Bismark能区分CpG、CHG和CHH，允许用户通过可视化来解释数据，首先介绍一下Bismark的比对原理。

亚硫酸氢盐文库有两种不同的类型，第一种情况是以带有方向的方式生成的序列文库，比如实际测序reads将对应于亚硫酸氢盐转换后的原始正向或反向链。在第二种情况下，链的特异性不被保留，这意味着所有四种可能的亚硫酸氢盐DNA链以大致相同的频率进行测序。

由于亚硫酸氢盐处理的reads对应的链特异性是未知的，Bismark旨在通过同时进行四个比对过程来确定唯一比对。首先，亚硫酸氢盐处理的reads进行C到T和G到A的转换。然后，每个reads与进行相同转换的参考基因组通过Bowtie进行比对。如下图所示：

这种比对方式使Bismark可以识别到唯一的reads原始链。所以，Bismark可以处理来自定向和非定向的BS-Seq数据。由于reads中剩余的C也进行了转换，所以可以准确地处理部分甲基化的情况。

许多以前的BS-Seq程序仅仅用于比对，这意味着获取潜在的甲基化数据需要大量后期处理和计算知识。除了比对功能，Bismark还能确定每个胞嘧啶甲基化状态，如下图所示：

哺乳动物甲基化主要是CpG的形式;然而，但还有一些非CpG的甲基化在胚胎干细胞中。在植物中，甲基化的形式有CpG、CHG、CHH（H可以是A，T或C）。为了分析不同形式的甲基化或模式生物，Bismark考虑了周围环境的序列，并能够区分CpG、CHG、CHH。

Bismark的输出结果中每条read占一行，并包含比对位置，比对的链，亚硫酸氢盐read序列，其比对到的基因组序列。该输出可以进行后续处理或用于提取单个胞嘧啶的甲基化信息。这种甲基化状态的结果由Bismark附带的甲基化提取器产生。该甲基化输出能区分CpG、CHG或CHH，链特异或混合链的格式都可以获得。前者可用于研究不对称甲基化（比如CHH甲基化）。甲基化提取器的输出将为每个胞嘧啶分配一行，使用链信息来编码其甲基化状态：'+'表示甲基，' - '非甲基化。该输出可以转换为其他比对格式，如SAM / BAM，或导入基因组浏览器的SeqMonk，这样就可以被可视化和进一步研究且不需要额外的计算处理。

可用比对模式表：

1 Bismark的安装

Bismark工作环境要求：

1，已安装perl和Bowtie（或Bowtie2）

2，需要有参考基因组序列（Bismark支持fasta和fa格式的基因组）

硬件要求：至少5个CpU和12个G的RAM(内存).运行bismark之前最好使用free检查一下内存，大于16G时更不容易出错。

Bismark安装：

从http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/bismark/上下载Bismark，其格式为.tar.gz，在linux系统下解压命令为tar -xzffile.tar.gz。

1 Bismark的使用

1，下载参考基因组：

ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/或者http://www.ensembl.org/info/data/ftp/index.html/

2，获取BS-Seq reads数据：

Bismark要求reads为.fa或者.fastq文件（从NCBI上下载的.sra文件需转为.fastq文件，可以使用sratoolkit工具）

3，导入参考基因组，建立比对使用的参考基因组：

命令：bismark_genome_preparation [options] <path_to_genome_folder>

结果：在基因组目录下产生Bisulfite_Genome目录

实例：bismark_genome_preparation --path_to_bowtie/Software/bowtie2-2.0.0-beta7/ --verbose --bowtie2 /Ensemble

参数：

--yes 如果有安全类问题则自动选择yes，比如覆盖某个已存在的文件。

--path_to_bowtie后面跟着的/Software/bowtie2-2.0.0-beta7/为bowtie目录的路径，

--verbose表示输出详细信息以方便调试。

--bowtie2指明此处使用的是Bowtie2，Bowtie1同理。

/Ensemble为需要导入的参考基因组的路径。

注：对于一套数据只需建立一次参考基因组。

4，使用bismark进行比对（使用默认参数）：

Bismark支持：

a)reads可以是序列格式：fastq或者fasta，也可以是压缩文件.gz

b)双末端或者单末端

c)read长度可变

d)定向和非定向的BS-Seqlibraries

命令：USAGE: bismark [options] <genome_folder> {-1 <mates1> -2<mates2> | <singles>}

结果：产生两个文件

①文件名_bismark.sam（序列比对结果的详细信息）

②文件名_bismark_mapping_report.txt（比对结果的总结）

实例： bismark -q --phred64-quals-n 1 -l 40 /data/genomes/homo_sapiens/GRCh37/ s_1_sequence.txt

参数：

-q 输入文件为FastQ，文件后缀通常为.fq 或者.fastq。

--phred64-quals 指定FastQ文件的质量分数格式，默认为phred33。

-n seed（read的一部分）中允许的最大错配数，可取0-3，默认为2。

-l 设置seed长度，质量好的一端的reads的碱基数，默认28。

5，提取甲基化水平

命令：methylation_extractor [options] <filenames>

实例： bismark_methylation_extractor -s -comprehensive --bedGraph --counts--cytosine_report --genome_folder /Ensemble /result/s.fastq_bt2_bismark.sam

更简洁的写法：bismark_methylation_extractor -s -comprehensive --bedGraph --countss.sam

参数：

-s指单末端数据，-comprehensive指把四条链的结果合并为一个文件

--bedGraph指将产生一个BedGraph文件存储CpG的甲基化信息

--counts指在bedGraph中有每个C上甲基化reads和非甲基化reads的数目

--genome_folder后跟着参考基因组的位置

--cytosine_report指报道全基因组所有的CpG。只有当指定

--cytosine_report时才需要genome_folder

（CpG、CHH、CHG的三个文件默认存储在当前目录下，bedGraph文件默认存储在SAM所在的目录下。sam文件和输出目录不能同时为绝对路径）

更详细说明的参见Bismark_User_Guide：

http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/bismark/

参考文献：

Chen,P.Y. et al. (2010) BS Seeker: precisemapping for bisulfite sequencing. BMC

Bioinformatics, 11, 203.

Cokus,S.J. et al. (2008) Bismark: aflexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq

applications. Bioinformatics Group.

Feng,S. et al. (2010) Conservation anddivergence of methylation patterning in plants

and animals. Proc. Natl Acad. Sci. USA,107, 8689–8694.

Harris,R.A. et al. (2010) Comparison ofsequencing-based methods to profile DNA

methylation and identification ofmonoallelic epigenetic modifications. Nat.

Biotechnol., 28, 1097–1105.

Langmead,B. et al. (2009) Ultrafast andmemory-efficient alignment of short DNA

sequences to the human genome. GenomeBiol., 10, R25.