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ctDNA TP53突变作为复发高级浆液性卵巢癌患者治疗响应标志物的探索性分析

摘要

循环肿瘤DNA(ctDNA)携带有肿瘤特异的突变序列，可以用来动态的评估肿瘤负担以及治疗响应，并且对患者侵害极小。体细胞TP53突变是高级浆液性卵巢癌（HGSOC）的一个特征突变。该研究检验了这些突变是否可以作为个性化标志用来检测肿瘤负担以及突变水平的早期改变是否可以作为治疗响应和疾病进展的预测因子。

研究对40个HGSOC患者的一系列血浆样本进行回顾性分析，这些患者接受了不同的临床治疗方案。对鉴定自FFPE肿瘤DNA的31个突变设计特异性TP53引物，通过dPCR对318例血浆样本中的TP53突变进行定量分析。并将TP53突变等位分数（TP53 mutant allele fraction (TP53MAF)）与血清CA-125（当前HGSOC血液治疗响应标志物的金标准）、肿瘤体积（计算机断层扫描）进行比较。并将一周期治疗后以上检查的变化与疾病进展时间（TTP）进行比较。

在51例复发性疗程中，治疗前的TP53MAF中值是8%（四分位数IQR：1.2%-22%），而7例新诊断未治疗的阶段III/IV的患者中值为0.7%（IQR：0.3%-2.0%）。TP53MAF与肿瘤体积检测显著相关(Pearson r = 0.59, p <0.001)，当把腹水患者排除后相关性更高（r=0.82）。复发患者中TP53/肿瘤体积(0.04% per cm3)比未治疗患者(0.0008% per cm3, p = 0.004)更高。肿瘤体积大于32 cm3的几乎所有患者中，血浆ctDNA大于20拷贝每毫升。在49例复发疾病疗程中，治疗前的TP53MAF浓度与TTP相关，而CA-125则未显示这一特征。化疗响应在ctDNA中更早的观察到，到达最低点的中值时间是37d (IQR 28–54)，而CA-125到达最低点的中值时间是84d (IQR 42–116)。在32例复发疗程（一周期化疗后响应可测）中，TP53MAF降低大于60%可以作为TTP的一个独立预测因子multivariable analysis (hazard ratio 0.22, 95%CI 0.07–0.67, p = 0.008)。反过来，TP53MAF降低<60%与较差的响应相关，TTP<6mo的灵敏度为71%(95% CI 42%–92%)，特异性为88%(95% CI 64%–99%)。当把腹水引流的患者排除后，特异性提升，因为腹水引流使得TP53MAF浓度降低。该研究的局限性在于回顾性设计，样本量小以及异质性治疗方案。

在这篇回顾性研究中，研究者证明了患有HGSOC的女性中ctDNA与其治疗起始肿瘤体积相关，一周期化疗后TTPMAF降低<60%与更短的TTP显著相关。这些结果证明ctDNA可能可以作为HGSOC的高度特异的早期分子响应标志，同时需要对大量接受统一治疗的样本进行进一步研究。

1 治疗前HGOC患者ctDNA中频繁地检测到突变TP53基因

在54例复发化疗疗程中，获取了32个复发患者的51例治疗前样本，使用数字PCR测定了样本中的TP53MAC and TP53MAF。发现51例样本中有42例TP53MAC>=20 AC/ml。

在7个新诊断的stage IIIC/IV的患者中，有6例在治疗前样本中检测到TP53MAC >= 20 AC/ml。

在复发患者中，治疗前TP53MAF中值为8%，新诊断的stageIIIC/IV的患者则为0.7%，4例手术切除的患者中为0.2%，且TP53MAF与CA-125相关(r = 0.49, p < 0.001)。

1 循环肿瘤DNA及肿瘤体积检测

对32个复发患者的51个疗程以及7个新诊断患者进行CT扫描检测肿瘤体积。其中有1例由于检测不到肿瘤而被排除。

Fig 2B显示了57个疗程案例中肿瘤体积的分布。大部分复发疗程中肿瘤体积>32 cm3 的样本TP53MAC均>=20 AC/ML,只有一个肿瘤体积为50cm3的患者TP53MAC为15AC/ml；大部分肿瘤体积<20cm3的患者TP53MAC< 20 AC/ml，有一例腹水患者肿瘤体积为1 cm3.

研究接下来考虑腹水或胸腔积液的存在是否会影响ctDNA和肿瘤体积之间的相关性，因为在临床实践中腹水频繁地改变CA-125的水平。该研究比较了腹水与非腹水患者ctDNA与肿瘤体积的相关性。在50个同时拥有治疗前ctDNA样本和CT检测的复发样本中，其中有10个CT检测与ctDNA样本收集间隔了14天，5个在CT检测和样本样本收集之间进行了腹水排水，这15个样本不纳入研究。对于剩下的35个样本，TP53MAF与体积呈现正相关(Pearson r = 0.59, p <0.001)。在这35例样本中，有13例CT显示存在腹水。当把腹水样本排除后分析发现TP53MAF与体积将的相关性更强(Pearson r = 0.59, p < 0.001)，暗示腹水中的ctDNA会对血液中的ctDNA水平产生影响。在所有的35个样本中以及在无腹水样本中，CA-125表现出与体积相关(Pearson r = 0.52, p = 0.001,and r = 0.51, p = 0.016,respectively)。22例非腹水复发样本中TP53MAF、CA-125与肿瘤体积的线性回归分析。阴影部分表示95%置信区间。

在非腹水患者中TP53MAF/volume的中位数为0.08% per cm3 (IQR 0.02%–0.13% per cm3)。TP53MAC与肿瘤体积的相关性则相对较低，TP53MAC/volume中位数为6.0 AC/ml per cm3。

1 复发患者与未治疗患者中TP53MAF与体积相关性的比较

决定ctDNA水平的因素目前了解的并不是十分清楚。比较复发患者和未治疗患者中治疗前TP53MAF/volume发现两者显著不同(p = 0.004, Wilcoxonrank-sum test; Fig E)。而两组样本的CA-125/volume值则差异并不显著(p = 0.063; Wilcoxon rank-sum test; Fig F)。50例复发样本中TP53MAF/volume中值为0.04% per cm3，7例新诊断未治疗的患者中TP53MAF/volume中值为0.0008% per cm3。

1 复发患者中治疗前TP53MAF与疾病进展时间相关

该研究接下来分析了在复发患者中，化疗前ctDNA水平与疾病进展是否相关。研究比较了TP53MAF、CA-125和TP53TAC与TTP之间的关系。在50例复发样本中，有一例由于ctDNA检测与治疗起始时间相差14天以上而被移除分析。患者平均随访时间为58 mo(range 43–70 mo)，且多有患者在随访期间均有疾病进展。在单变量分析中，TP53MAF，CA-125，TP53TAC，年龄，铂类药物敏感性，化疗方案，肿瘤体积均是TTP的显著预测因子。

当使用多变量比例风险模型校正后，只有TP53MAF(hazard ratio [HR]1.03, 95% CI 1.01–1.06, p = 0.019)和铂类药物敏感性(HR 0.43, 95% CI 0.19–0.99, p = 0.048)依然是显著的。治疗前TP53MAF低于平均水平的样本的TTP比高于平均水平样本的PPT显著长(p = 0.001 by logrank test; Fig G)。单变量分析中治疗前TP53MAC可以显著预测TTP，多分析中则不能。

1 化疗期间TP53MAF反应动力学与最低值

该研究接下来通过测量化疗周期后TP53MAF达到最低值的时间来分析治疗期间TP53MAF的动力学。其中，只有一部分的化疗疗程在每个治疗周期都有连续可以用于评估最低点的血浆样本。

Nadir analysis纳入标准：

ctDNA检测基线为≥20 amplifications/ml；

连续取样中每周期至少一个样本到达最低点或者为0；

对于完成一个疗程或者疾病有进展时ctDNA浓度仍在降低的，将最后一次测量作为ctDNA浓度最低点；

ctDNA可检测并且患者至少经理一周期的治疗

排除进行了腹水引流或者放射治疗的患者样本

在27个疗程中，有26个到达了最低TP53MAF，21个到达了最低CA-125.

只有一个发生了脑转移的疗程样本(patient 57)TP53MAF未曾下降。TP53MAF到达最低点的平均时间为37天(IQR28–54)，而CA-125为84天(IQR 42–116)。到达最低点时TP53MAF平均降低了98%，CA-125平均降低了55%。

研究还发现，与CA-125相比，TP53MAF下降的更快且变化更大。在大多数样本中，TP53MAF与CA-125的趋势与连续治疗周期相似。而在其中两个样本中观察到不一致的动力学，TP53MAF上升的同时CA-125下降。在这俩样本中，CT检测发现肿瘤都恶化了，包括发生脑转移的患者57. Fig F腹水引流对血浆TP53MAF的影响。腹水引流导致了TP53MAF的下降，说明引流会引起血浆ctDNA的快速改变，可能会混淆响应检测之间的比较结果。

1 一周期治疗后TP53MAF的改变预测Time to Progression

对于复发性HGSOC患者来讲，化疗响应与抗性的早期预测对其临床治疗具有重要的意义。该研究接下来验证了一周期化疗后TP53MAF的降低是否可以预测TTP，并与CA-125进行比较。总共有32例化疗样本，这些样本同时具有匹配的第一、二周期治疗样本，且可用于评估治疗响应。在这些样本中，22例使用了铂类药物化疗，10例则是非铂类药物化疗。从开始化疗(cycle 1)到样本收集（pre-cycle 2）的平均时间为28天(IQR 21–28)。从pre-treatment到the pre-cycle-2 TP53MAF平均降低74% (IQR 55%–89%)，CA-125平均下降18% (IQR -46%-12%)，平均TTP为189天。

为了确定预测TTP的TP53MAF最佳降低值，研究中通过绘制ROC曲线，并且6 mo TTP是临床显著的时间点。ROC曲线鉴定TP53MAF 60%的降低点作为最佳预测因子（根据灵敏度和特异性判断）(Fig A)，将该阈值用于后续分析。TP53MAF降低<=60%组的平均TTP为94天，>60%组的平均TTP为230.在单变量分析中，肿瘤体积能够显著地预测TTP；在多变量分析中则不显著，CA-125水平也无法显著预测TTP。此外，一周期治疗后TP53MAC、治疗前TP53MAC也无法预测TTP，表明TP53MAF对TTP最有预测价值。

由于腹水引流会影响治疗响应的评估，将近期进行了腹水引流的患者排除后重新分析，ROC切点仍然是60% (Fig C)。当TP53MAF下降小于60%或大于60%时，平均TTP分别为76天和229天。

一周期化疗后decrease of<=60%的TP53MAF预测TTP<6 mo的灵敏度和特异性分别为71% and 88%，当把腹水引流患者排除后，灵敏度和特异性分别为75% and100%。

治疗前到化疗第三周期前的TP53MAF改变仍然能够显著的预测TTP。TP53MAF降低最佳分割点为80%，多变量分析HR为0.26 (95% CI 0.07–0.92, p = 0.037)。一周期化疗后和两周期化疗后的治疗响应分类是一致的。

参考文献：

ParkinsonCA, Gale D, Piskorz AM, Biggs H, Hodgkin C, Addley H, Freeman S, Moyle P, SalaE, Sayal K, Hosking K, Gounaris I, Jimenez-Linan M, Earl HM, Qian W, RosenfeldN, Brenton JD. Exploratory Analysis of TP53 Mutations in Circulating Tumour DNAas Biomarkers of Treatment Response for Patients with Relapsed High-GradeSerous Ovarian Carcinoma: A Retrospective Study. PLoS Med.2016;13(12):e1002198.

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