RT-qPCR

RT-qPCR：以cDNA为模板进行PCR，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检 测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量

• 探针类：包括TaqMan探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加； 
• 非探针类：其中包括如SYBR Green I或者特殊设计的引物(如LUX Primers) 通过荧光染料来指示产物的 增加
• 在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和 Ct值。 
  基线（baseline）：一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。 
  阈值（threshold）：阈值一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节，位于指数期 就可以。 
  Ct值（Ct value）：Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。所以是一个没有单位的参数。跟初 始模板的量呈反比。

步骤：

1. 配置PCR反应液： Takara RR820A试剂盒
   于冰上配制如下反应体系。
   试剂 使用量
   SYBR Premix Ex Taq II (2) 10.0μL
   PCR Forward Primer (10uM) 0.8μL
   PCR Reverse Primer (10uM) 0.8μL
   ROX Reference Dye II (50) 0.4μL
   cDNA 溶液 2.0μL
   DEPC 水 6.0μL
   Total 20.0μL
2. 两步法扩增：Stage 1: 预变性 95℃ 30s
   Stage 2: PCR 反应 95℃ 5s 60℃ 30s，40cycles