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RT-qPCR

RT-qPCR:以cDNA为模板进行PCR,在PCR扩增过程中,通过收集荧光信号,对PCR进程进行实时检 测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以可以定量

  • 探针类:包括TaqMan探针和分子信标,利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加; 
  • 非探针类:其中包括如SYBR Green I或者特殊设计的引物(如LUX Primers) 通过荧光染料来指示产物的 增加
  • 在实时PCR扩增过程中,荧光信号被收集,转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线,荧光阈值和 Ct值。 
    基线(baseline):一般来讲,第3-15个循环的荧光值就是基线,是由于测量的偶然误差引起的。 
    阈值(threshold):阈值一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节,位于指数期 就可以。 
    Ct值(Ct value):Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。所以是一个没有单位的参数。跟初 始模板的量呈反比。

步骤:

  1. 配置PCR反应液: Takara RR820A试剂盒
    于冰上配制如下反应体系。
    试剂 使用量
    SYBR Premix Ex Taq II (2) 10.0μL
    PCR Forward Primer (10uM) 0.8μL
    PCR Reverse Primer (10uM) 0.8μL
    ROX Reference Dye II (50) 0.4μL
    cDNA 溶液 2.0μL
    DEPC 水 6.0μL
    Total 20.0μL
  2. 两步法扩增:Stage 1: 预变性 95℃ 30s
    Stage 2: PCR 反应 95℃ 5s 60℃ 30s,40cycles
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错误分析

作者:嘉期几许

原文链接:https://www.jianshu.com/p/3b6cc84cea53

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